Skip to content

Molekularne podstawy fenotypowej heterogenności w fenyloketonurii cd

2 miesiące ago

434 words

Charakterystyczne mutacje hydroksylazy fenyloalaniny wśród białych pacjentów z fenyloketonurią. Regiony genów zawierających geny hydroksylazy fenyloalaniny zostały zamplifikowane z genomowego DNA każdego pacjenta w celu wykrycia mutacji fenyloketonurii, o których wiadomo, że występują w białych populacjach (Tabela 1). Genomowy DNA wyizolowano z leukocytów i zamplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy z zastosowaniem polimerazy Taq (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA), jak opisano wcześniej. 20 Amplifikowane próbki immobilizowano na błonach zeta-sondy (Bio-Rad, Richmond , Calif.) Z kolektorem typu dot-blot (Schleicher i Schuell, Keene, NH), a obecność lub brak mutacji fenyloketonurowych w amplifikowanym genomowym DNA określono za pomocą analizy hybrydyzacji swoistej dla oligonukleotydu allelu.27, 28 Analiza hybrydyzacji próbki od duńskich pacjentów przeprowadzono w Houston i Kopenhadze oraz analizę próbek od pacjentów niemieckich i innych pacjentów w Heidelbergu. Sondy oligonukleotydowe specyficzne dla normalnych lub zmutowanych alleli uzyskano komercyjnie (Genosys, Houston) i znakowano końcowo .- [32P] ATP (6000 Ci na milimol) (New England Nuclear, Boston) z użyciem kinazy polinukleotydowej (Pharmacia, Piscataway, NJ). Analiza ekspresji
Mutacje bzdur zweryfikowano za pomocą analizy ekspresji w hodowanych komórkach ssaczych. Mutagenezę ukierunkowaną wykorzystano do wprowadzenia specyficznych podstawień zasad do fragmentu cDNA ludzkiej hydroksylazy fenyloalaniny o pełnej długości, uzyskanego pierwotnie od zdrowego osobnika.29 Następnie zmutowano zmutowane i normalne cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pCDNAI (Invitrogen, San Diego). , Kalifornia). Każdy uzyskany wektor ekspresyjny wraz z wektorem pCDNAI zawierającym cDNA .-galaktozydazy został wprowadzony do komórek COS małpy i nerki przez elektroporację30. Ekspresję RNA informacyjnego hydroksylazy fenyloalaniny (mRNA), aktywność enzymu i immunoreaktywność określono w ekstraktach komórkowych. [32] Poziomy aktywności hydroksylazy fenyloalaniny w komórkach transfekowanych różnymi cDNA zmutowanej fenyloalaniny lub normalnym cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej znormalizowano dla względnych zmian poziomów mRNA i aktywności .-galaktozydazy, co zmierzono w sposób opisany przez Nielsena i wsp. 33. Poziom aktywności hydroksylazy fenyloalaniny w komórkach transfekowanych cDNA zmutowanej fenyloalaniny cDNA wyrażono jako procent poziomu w komórkach transfekowanych cDNA hydroksylazy normalnej fenyloalaniny. Chociaż włączenie zarówno prawidłowego, jak i zmutowanego cDNA hydroksylazy fenyloalaniny i cDNA .-galaktozydazy do tego samego wektora ekspresyjnego byłoby optymalne, w tym przypadku ekspresja współbieżna odzwierciedlałaby wydajność transfekcji pojedynczego wektora, normalizację poziomu zmutowanego enzymu hydroksylazy fenyloalaniny. Aktywność skutecznie wyklucza możliwy wpływ jakichkolwiek różnic w wydajności transfekcji wektorów hydroksylazy fenyloalaniny w stosunku do wektora. -galaktozydazy.
Obliczanie przewidywanej aktywności hydroksylazy fenyloalaninowej
Poziomy aktywności enzymu hydroksylazy fenyloalaniny pochodzące z analizy ekspresji in vitro zmutowanych i prawidłowych cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej zastosowano do przewidywania poziomu aktywności u pacjentów ze znanymi genotypami.
[patrz też: echo serca łódź, usg kolana szczecin, test na nietolerancję pokarmową cena ]

0 thoughts on “Molekularne podstawy fenotypowej heterogenności w fenyloketonurii cd”